Клеточная инженерия
Клеточная инженерия растений
Основной задачей клеточной инженерии является конструирование новых форм растений с желаемыми признаками. Перспективный метод получения дальнеродственных гибридов основывается на новой экспериментальной технике – парасексуальной гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации растений идут по трем основным направлениям:
- изучение и реконструкция плазмагенов (генетический материал, локализованный вне ядра);
- исследования по гибридизации клеток филогенетически отдаленных видов растений;
- получение с помощью слияния протопластов соматических гибридов, представляющих практический интерес для селекции.
Основные различия соматической гибридизации от полового скрещивания заключаются в следующем. Во-первых, с помощью половой гибридизации могут скрещиваться только растительные формы с нормальным морфогенезом и гаметогенезом. Презиготическую несовместимость можно преодолеть с помощью метода слияния протопластов. Во-вторых, половой процесс симметричен, то есть гаметы привносят в зиготу равные наборы ядерного генетического материала от обоих родителей. Продукты же слияния протопластов часто являются асимметричными гибридами, представляющими ценные формы, содержащие весь хромосомный набор культурного вида и лишь несколько хромосом или генов дикого родителя. В-третьих, внеядерный генетический материал у большинства растений при половом скрещивании наследуется строго однородительски – по материнской линии. Слияние протопластов позволяет получать уникальные сочетания митохондриальных и хлоропластных генов. И, наконец, четвертое отличие заключается в том, что половая гибридизация возможна только между филогенетически близкими видами растений. При соматической гибридизации возможно получение гибридов филогенетически отдаленных форм, которые обычным путем скрестить невозможно.
Слияние протопластов начинается с установления контакта (адгезии) между празмалеммами соседних протопластов. Одновременно происходит изменение свойств мембран, приводящие к их слиянию. Расширение локальных цитоплазматических мостиков приводит к объединению цитоплазм с образованием гибридных клеток – цибридов.
Для формирования из гибридных протопластов растений, протопласты необходимо культивировать, чтобы они могли делиться и образовывать каллус, из которого впоследствии может регенерировать целое растение. Возрастает количество видов, для которых удалось провести весь цикл “Растение – Протопласты – Каллус – Растение”.
Одним из важнейших моментов при проведении соматической гибридизации является отделение образовавшихся гибридных клеток от родительских. Селекция парасексуальных гибридов может проводиться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации растений. Селекция на стадии регенерации растений имеет ряд существенных недостатков, осложняющих такой отбор: 1) нет уверенности, что все гибридные растения не являются потомками единственной гибридной клетки- 2) длительное время, требуемое для селекции регенерантов- 3) большая трудоемкость. В связи с этим, разрабатываются методы отбора соматических гибридов на клеточном уровне. Наиболее распространенными являются методы: 1) механической изоляции- 2) генетической комплементации- 3) физиологической комплементации- 4) физического обогащения.
Видео: Наука 2.0. Роговица. Клеточная инженерия
В популяции растительных клеток in vitro после их слияния могут иметь место различные нежелательные генетические изменения (полиплоидия, хромосомные перестройки, различные мутации), приводящие к появлению форм, фенотипически сходных с гибридными. Кроме того, агрегация исходных родительских клеток может привести к образованию химерных тканей (растений). В связи с этим, отобранные формы соматических гибридов должны подвергаться дополнительным анализам для проверки их гибридности. Гибридологический анализ позволяет проводить оценку потомства F1 после самоопыления. Цитогенетический анализ основан на изучении числа и морфологии хромосом гибридных и родительских клеток. Более информативен метод дифференциального окрашивания хромосом. Цитогенетический анализ наиболее доказателен для дальнеродственных комбинаций – межсемейственных и межтрибных.
Определение ферментативной активности и изучение спектра изоферментов позволяет выявить гибридную природу изучаемого материала. При этом в спектрах изоферментов гибрида должны совмещаться зоны, характерные для каждого из родителей. Большое значение имеет физиологическая стабильность различных форм изоферментов в зависимости от дифференцировки используемых для анализа клеток.
Анализ белка “Фракция 1”. Этот белок локализован в хлоропластах и представляет собой фермент рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазу с оксигеназной активностью и состоит из большой и малой субъединиц. Полипептидный состав обеих субъединиц различен у разных видов растений, поэтому этот белок является маркером при изучении меджвидовых гибридов. Малая субъединица кодируется ядерным геномом и наследуется двуродительски. Большая субъединица наследуется однородительски (матерински) и кодируется пластомом. Анализ белка позволяет получить доказательство гибридности материала и исключить химеризм.
Рестриктный анализ ДНК органелл. Анализ ДНК органелл с помощью рестриктаз является быстрым и точным методом определения гибридности по цитоплазмону. Рестриктные спектры, получаемые в результате электрофореза видоспецефичны и могут быть использованы для характеристики ДНК органелл.
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Применяют как ДНК-ДНК, так и ДНК-РНК-гибридизацию. Степень молекулярной гибридизуемости используется для характеристики систематического и филогенетического родства видов. Метод молекулярной гибридизации перспективен при изучении природы парасексуальных гибридов, особенно гибридов филогенетически отдаленных видов. В случае, когда хромосомный анализ не в состоянии выявить наличие в клетках гибридов хромосомного материала одного из родителей, наиболее подходящим методом для анализа гибридов является именно метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.
Фенотипическая изменчивость, наблюдаемая у соматических гибридов, является отражением тех генетических явлений, которые происходят до регенерации и указывают на следующие 4 источника изменчивости: 1) ядерная несовместимость- 2) межгеномная митотическая рекомбинация- 3) сомаклональная изменчивость- 4) органоидное расщепление.
Существуют следующие ограничения, мешающие полному успеху метода соматической гибридизации: 1) применение этого метода требует эффективной регенерации растений из протопластов- 2) соматические гибриды не поддаются половому размножению, все межвидовые соматические гибриды являются стерильными- 3) для того, чтобы перенести полезные гены из диких видов в культурные, необходимо осуществить межгеномную рекомбинацию или хромосомные замещения между двумя видами- 4) при слиянии протопластов получаются растения с суммированн ым числом хромосом. Однако быстрый прогресс в совершенствовании методов клеточной инженерии позволяет надеяться, что соматическая гибридизация как новая биотехнология станет основной в селекции для получения жизнеспособных гибридов нескрещивающихся видов растений.
Реконструкция клетки является еще одним бурно развивающимся направлением клеточной инженерии. Речь идет о сборке совершенно новой клетки за счет объединения (слияния) изолированных клеточных фрагментов друг с другом или с целыми клетками. В результате такой реконструкции можно создать клетку, ранее в природе не существовавшую. Однако многие проблемы, стоящие на пути исследований в данном направлении, связаны с ограниченным числом подходящих методик фрагментации и выделения гомогенных популяций интактных клеточных фрагментов.
Видео: Генная инженерия
Существует ряд методик по введению чужеродных хлоропластов в изолированные протопласты. Одна из методик предусматривает последовательное центрифугирование протопластов и пластид в 0,03% растворе лизоцима, который обладает модифицирующим действием на мембрану. Частота проникновения чужеродных органелл в протопласты в данном случае составляет 0,5%. Другой метод заключается в том, что изолированные одиночные клетки инкубируют с ферментом целлюлазой. После появления первых протопластов клетки переносят в суспензию хлоропластов в 2% растворе целлюлазы и 0,2 М NaNo3при рН 5,4.. С помощью этого метода проведено успешное включение в протопласты функционально активных хлоропластов с дальнейшей регенерацией целых растений. Осуществлена пересадка пластид черного паслена, несущих гены, контролирующие устойчивость к атразину, культурному картофелю. Анализ хлоропластной ДНК устойчивых к атразину растений-регенерантов картофеля показал, что хлоропласты этих линий произошли от паслена.
Перенос высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растений. Среди большого разнообразия генетически измененных форм растений, образовавшихся из слившихся протопластов, встречаются формы, содержащие пластиды одного родителя, а митохондрии другого, и наоборот.
Новым направлением клеточной инженерии растений является создание необычных биологических систем путем введения микрорганизмов в популяцию культивируемых клеток. Создание таких ассоциаций представляет интерес для решения следующих задач: 1) экспериментальной проверки теории эндосимбиотического происхождения эукариотической клетки в процессе эволюции- 2) моделирования природных симбиотических отношений растений микроорганизмов- 3) повышения продуктивности культивируемых растительных клеток- 4) получения растений с новыми свойствами- 5) изучения различных аспектов взаимодействия растения-хозяина и патогена.
Получение искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа на основе культивируемых клеток или изолированных протопластов с микроорганизмами является одним из новых способов модификации растительной клетки. Довольно перспективным является получение ассоциаций культур клеток растений с микроорганизмами, способными к фиксации молекулярного азота атмосферы. Способность к формированию азотфиксирующих симбиотических систем приобрели определенные группы высших растений и микроорганизмов . В связи с этим вопрос о повышении способности к вступлению в такие симбиотические ассоциации для большинства растений имеет важное экономические значение и может быть решен методами клеточной инженерии.
Следовательно, становится возможным конструирование клеток с новыми свойствами. Реконструированные клетки, происходящие из ядра и цитоплазмы разного происхождения, являются удобными экспериментальными моделями для решения таких важных биологических проблем, как дифференцировка, старение клеток, цитоплазматическая наследственность. Гибриды растений с генетически реконструированной цитоплазмой представляют собой весьма ценный материал для оценки влияния двух цитоплазматических генофоров на различные практически значимые признаки возделываемых культур.
