Зеленые белки раскрыли тайну возрождения саламандры

Новые уроки отращивания конечностей преподал учёным мексиканский аксолотль (Ambystoma mexicanum). Это создание — один из самых выдающихся примеров самовосстановления в животном мире.

Что там хвост, как у некоторых ящериц: аксолотль успешно отращивает новую полностью функциональную лапку, взамен отсечённой, скрупулёзно воссоздавая все косточки, все мускулы, кожу, сосуды, нервные волокна... На это уходит лишь три недели. Повреждённые лёгкие или спинной мозг также у данных саламандр (да и у ряда других), реконструируются замечательно. И шрамов не остаётся. Вот бы и нам так.

Давно известно, что начинается восстановление органа с появления бластемы — похожего на опухоль скопления клеток, которые затем размножаются и превращаются в различные ткани. Эти новые клетки порождаются обычными клетками на месте повреждения, но при этом клетки бластемы — недифференцированные. Однако они каким-то образом узнают, во что им потом превращаться. Так что вместо утраченной ноги никоим образом не может появиться хвост. Эта система управления — настоящая загадка, завесу тайны над которой приподняли новые опыты.

Общая схема экспериментов: трансгенное животное синтезирует флуоресцентный белок во всех своих тканях. Интересующий учёных конкретный тип клеток от этого экземпляра пересаживают обычному животному, у которого затем отрезают конечность. После прохождения стадии бластемы конечность отращивается заново, а флуоресцирующие маркеры позволяют точно установить – в какой тип клеток превратились пересаженные "пришельцы" (фото Martin Kragl et.al.).

Ранее биологи предполагали, что клетки бластемы — плюрипотентные, то есть каждая из них может стать клеткой кожи, мышечной ткани и так далее, давая начало росту той или иной ткани. Группа исследователей из Германии и США, опубликовавшая статью в Nature, показала — это представление ошибочно.

Чтобы выяснить тонкости регенерации, учёные внедрили ген, отвечающий за синтез зелёного флуоресцирующего белка (знаменитый "нобелевский GFP", столь важный для подводных организмов) в аксолотлей.

Далее биологи поочерёдно брали у трансгенных животных те или иные клетки и внедряли их немодифицированным саламандрам в район будущей травмы. А поскольку генетическая информация о GFP сохранялась у всех клеток — потомков клеток заимствованных, их положение в организме, в том числе — в заново выращенном органе, можно было с высокой точностью отследить.

Так открылся удивительный секрет.

Клетки бластемы — не идентичны, хотя ещё и не являются клетками тех или иных тканей. Но они помнят — от каких клеток произошли и таким образом бывшие клетки мышечной ткани производят только мышцы, клетки нервных волокон — новые нервы, клетки кожи — кожу и так далее (за редкими исключениями, о них — чуть ниже).

"У многих людей сложилось впечатление, что эти самые клетки бластемы были все одним и тем же", — говорит Танака. Однако получилось, что бластема — это не однородная клеточная масса, а скопление прогениторов, порождённых различными тканями, которые, в свою очередь, порождают каждый свою специфическую ткань.

То есть, несмотря на стадию бластемы, эти стволовые клетки остаются по сути разными на протяжении всего процесса регенерации.

После того, как конечность выросла заново, ранее заимствованные шванновские клетки, несущие ген GFP, распространяются и множатся точно вдоль нервных волокон, создавая их оболочки. И притом никакие другие клетки исходных тканей не превращаются в шванновские (фото D.Knapp/E.Tanaka).

В частности эксперименты показали, что шванновские клетки (составляющие защитную оболочку периферических нервных волокон), полученные подопытным земноводным от трансгенного экземпляра (а потому — светящиеся зелёным), после стадии будто бы плюрипотентных стволовых клеток (как полагали ранее) порождают в выращенной заново ноге только шванновские клетки.

Исключения относятся к внутреннему слою кожи, где бывшие клетки кожи могут в новой конечности обратится хрящевыми клетками (и мигрировать к правильной позиции) или клетками сухожилия. Но мышцами, допустим, им не стать.

Бывшие до бластемы клетки мышц в новой конечности животного не станут клетками кожи или хрящей, клетки хрящей — не станут мускулами и так далее, — объясняют биологи суть открытия. Точно также, как никакие клетки, кроме клеток Шванна, пройдя недифференцированную фазу, не обратятся клетками Шванна в новом органе.

Этот результат противоречил ранее полученным данным самих исследователей. Элли в частности уже показывала, что единственное мышечное волокно в регенерируемой конечности может обратиться в клетки разных типов. А это заставило учёных задуматься: какое же сложное перепрограммирование самой природой идёт в таких клетках?

А оказалось — никакого глубокого перепрограммирования нет и всё гораздо проще и изящнее. Предыдущие исследования применяли намного менее точные методы отслеживания перемещения клеток, в частности красители, которые могли "убежать" к другим клеткам — так объясняют авторы нового опыта свою прежнюю ошибку.

Аксолотль, в частности показанный тут мексиканский, как и получающиеся из них взрослые амбистомы, нередко встречается в аквариумах. Этих земноводных разводят во многих странах (фотографии wikipedia.org, Grzegorz Z., Dot Stasny, Andrew Little, chinabreed.com, patries71/flickr.com).

Исследователи также обнаружили, что некоторые клетки, помнят не только свою идентичность, но и положение в организме. Клетки хряща, например, помнят, что ранее они образовывали плечо, или нижнюю часть конечности, и мигрируют туда же в новом органе, в то время как все клетки Шванна без разбора просто перемещаются в любое место, где они нужны.

Танака говорит, что эта работа спровоцирует крупный сдвиг в мышлении о требованиях к регенерации. Объясняя, почему саламандры могут восстанавливать конечности, а люди нет, она поясняет: "Гипотеза заключалась в том, что саламандры могут сильно изменять идентичность клеток".

Но на самом деле, их клетки никогда не утрачивают своей "самобытности", — следует из новых экспериментов, — напротив, саламандры, как представляется, используют "ограниченные" в своих возможностях стволовые клетки от конкретных тканей, способные генерировать лишь определённую часть новой конечности.

Регенерированная конечность саламандры. Клетки Шванна флуоресцируют зелёным, показывая, что они окружают нервы (красный цвет). В других клетках (синий), этого зёлёного белка не наблюдается, а значит шванновские клетки не превращаются в клетки других типов (фото D. Knapp/E. Tanaka).

Танака указывает на то, что люди также обладают стволовыми клетками конкретных тканей, которые заменяют соответствующие виды тканей. Только у нас такое заживление идёт медленно. "Саламандры не делают что-то намного более сложное, чем способны делать стволовые клетки человека", — радуется исследовательница.

А значит, подталкивание человеческих клеток к регенерации, возможно, не потребует столь радикального шага, как превращение клеток в плюрипотентные, чем наперебой занимаются во многих университетах и институтах, демонстрируя порой потрясающие результаты.

Но теперь выходит, что патент природы не предусматривает возврат "клеточных часов" на столь много шагов назад, а происходит лишь небольшой "откат". И процесс этот больше напоминает эксперименты с прямым перепрограммированием одних типов клеток в другие, минуя плюрипотентную стадию.

Вверху: распространение шванновских клеток на 3-й, 7-й, 18-й и 25-й день после ампутации. Внизу: различные маркеры и методы визуализации позволили учёным чётко отделить одни типы клеток от других (фото Martin Kragl et.al.).

Алехандро Санчес Альварадо (Alejandro Sanchez Alvarado), исследователь из университета Юты и медицинского института Говарда Хьюза, также изучающий феномен регенерации конечностей у земноводных, признаёт, что метод генетической "татуировки" пересаживаемых клеток — замечательный новый способ исследования регенерации тканей. И он, мол, показывает, что гипотеза о неоднородности клеток бластемы верна. (Кстати, в том же журнале Nature Альварадо опубликовал собственную работу на данную тему).

Но он предупреждает, что учёным ещё необходимо определить, является ли этот принцип верным и для взрослых аксолотлей, и для тритонов? Если тот же самый механизм лежит в основе других примеров регенерации, это в корне изменит представления учёных об условиях данного замечательного процесса, — говорит Алехандро.

Но остаётся без ответа основной вопрос: если люди уже имеют стволовые клетки от разных дифференцированных тканей, что всё же составляет разницу между нашими клетками и клетками саламандр? И шире — других животных?

Открывали же биологи невиданную регенерацию тканей у мышей, добивались регенерации крыла у цыплёнка, с геном восстановления червя разобрались — получается — есть скрытые резервы.

Танака и её коллеги намерены разобраться с этим вопросом: они ещё будут проводить опыты в надежде выяснить, какие именно гены включаются на тех или иных стадиях процесса и какие молекулярные сигналы побуждают клетки на месте раны формировать бластему и следовать по всему дальнейшему пути к воссозданию конечности.